一、計數生物指示劑分類：

1、濾紙片類：孢子載體為濾紙

1）與培養液分離，滅菌完畢將培養液與濾紙片接觸，依據培養液顏色變化確認滅菌效果。

2）不含培養液，滅菌完畢接種至培養基培養，依據培養基渾濁與否確認滅菌效果。

2、孢子懸液類：孢子載體為液體，直接分散于培養液中，一般整體為安瓿包裝，滅菌完畢直接培養，依據培養液顏色變化確認滅菌效果。

3、不銹鋼片類：孢子載體為不銹鋼片（圓形或長條形），不含培養液，滅菌完畢接種至培養基培養，依據培養基渾濁與否確認滅菌效果。

二、濾紙片類生物指示劑計數方法

1、檢驗所需儀器及物品：

1）儀器：

生物安全柜、通用水浴、振蕩器、培養箱、100~1000μl移液槍、計時器。

2）培養基：

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA），至少200ml/瓶×1瓶，融化后45~50℃水浴保溫不超過8h

3）滅菌物品：

a）90mm平皿×8個、1ml帶濾芯槍頭×1盒（含槍頭至少20個，滅菌前先用剪刀剪短頭端約2mm，防止濾紙堵塞影響計數結果）、直徑4-6mm玻璃珠24個、50ml平底試管×4支，經濕熱滅菌124℃、50min后備用，效期內。

b）無菌純化水：9ml/支試管×12支，100ml/瓶三角瓶×1瓶，經濕熱滅菌121℃、15min后備用，效期內。

c） 具體滅菌程序按各滅菌器使用及維護標準操作規程進行。

d）其他物品：

溫度控制管：1套，包含10ml純化水的試管中同時插入1支水銀溫度計（溫度范圍50~100℃）；

酒精燈、不銹鋼剪刀、刀片、不銹鋼鑷子、無菌75%酒精棉球（效期內）、記號筆等。

2、 檢驗環境條件：

陽性對照室活菌操作區的生物安全柜內。

3、檢驗前準備：

1） 預熱通用水浴，設定溫度為99.0℃。

2）人員和物品按照《微生物檢驗用實驗室人物流進出標準操作規程》入室。

4、檢驗步驟：

1）取待檢濾紙片類生物指示劑4支，確認生物指示劑外型完整無破損。

2）用不銹鋼剪刀剪開或刀片劃開塑料管蓋或其他包裝，用無菌鑷子取出濾紙片，將濾紙片加入1支無菌平底試管中，在該試管中加入5ml的無菌純化水及6顆無菌玻璃珠，平行制備4管，分別記為A、B、C、D管。

3）將4根平底試管放在振蕩器上分別振蕩7min，直到濾紙條浸漬成漿狀（如下圖所示），再在每管中加入5ml無菌純化水，再次振蕩8min。

4）將溫度控制管放入已預熱的水浴中，當溫度控制管中溫度顯示達到或超過95.0℃時，將振蕩后的4支平底試管（含10ml無菌純化水、玻璃珠及*浸漬的濾紙）放入水浴中，使用計時器開始計時，在95~100℃持續熱擊15min。

5）熱擊完畢后，立即將4支平底試管取出，置于冰浴（0~4℃）中5min（計時器計時）。

6） 取冰浴后的4支試管按下述方法操作。

7）取A管平底試管（10-1），用移液槍從試管中吸取1ml試管中的溶液至無菌純化水管（9ml/支）中，記為10-2，在振蕩器上振蕩10-2管10s，再吸取1ml的10-2管溶液至另一無菌純化水管（9ml/支）中，記為10-3，在振蕩器上振蕩10-3管10s，同法操作稀釋至10-4管（計數管），上述稀釋過程以指示劑質量報告中標示孢子數為6次方為例，為確保稀釋管中的溶液混合均勻以獲得準確的計數，振蕩后要立即移液，沉降的溶液在移液前需要再次振蕩。

8）稀釋倍數=生物指示劑質量報告中標示孢子數的指數－2，若標示量為2.3×105，則稀釋倍數為5－2=3，即稀釋至10-3管計數即可。

9）取計數管在振蕩器上振蕩10s，用移液槍吸取1ml的計數管溶液按檢驗用菌株稀釋及計數標準操作規程的澆注法進行計數確認，計數用培養基為胰酪大豆胨瓊脂培養基/胰酪大豆胨瓊脂對照培養基，平行制備2塊計數平皿，

10）其余BCD管同7）-9）項下操作，ABCD 4支平底試管共計制備8塊計數平皿。

11）按《微生物檢驗用實驗室清潔衛生標準操作規程》做完清潔后，人員及物品按照《微生物檢驗用實驗室人物流進出標準操作規程》出室。

12）實驗過程填寫《生物指示劑孢子含量測定記錄（濾紙片類）》及使用設備的相關記錄。

5、培養：

將計數平皿（ABCD管各2塊，共8塊）置于培養箱中，參照生物指示劑質量報告中該菌株孢子要求的培養溫度進行培養，除特殊菌株外，一般培養48h計數。

6、計算：

計數平皿均值（修約至個位）=（（A管計數平皿1#+2#）+（B管計數平皿1#+2#）+（C管計數平皿1#+2#）+（D管計數平皿1#+2#））÷8

回收率=計數平皿均值×10稀釋倍數（指數中的稀釋倍數即4檢驗步驟的8）項下的稀釋倍數）÷生物指示劑標示孢子數×100%